Küsimus:
Mis määrab eduka valgu ekspressiooni E. colis?
Gergana Vandova
2011-12-17 01:54:43 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Mõned valgud ekspresseerivad heteroloogses peremeesorganismis hästi; teised- mitte. Valgu ekspressiooni määramiseks on teada mõned nõuded, näiteks tugev promootor (nagu T7) transkriptsiooniks ja tugev ribosoomi sidumissait translatsiooniks. Töötan valguga, mis koosneb 2 alaühikust - alfa ja beeta. Mõlemad asuvad plasmiidil T7 promootoriga beeta-subühiku ees (st konstrukt on T7 promootor, CDS beeta-subühiku jaoks, CDS alfa-subühiku jaoks). Beeta-subühik väljendab hästi, kuid alfa seda ei tee. Kas see on midagi pistmist kohaliku keskkonnaga (promootorid, RBS-id jne) ja kui palju see sellest sõltub? Kuidas suurendada valgu ekspressiooni?

Mõned aspektid pole minu jaoks täiesti selged. Kaks alaühikut ekspresseeritakse eraldi plasmiididel või? Ja kõik plasmiidides on ühesugused, välja arvatud tegelik valgujärjestus?
Kaks alaühikut asuvad samal plasmiidil. Plasmiidjärjestus algab T7 promootoriga, RBS1, beeta-subühik, RBS2, alfa-subühik. RBS-i järjestused on natuke erinevad, nii et mõtlesin need samaks muuta, kuid see ei tohiks valgu ekspressioonile suurt mõju avaldada. (need on konsensuse järjestusele väga lähedal).
Neli vastused:
#1
+9
Mad Scientist
2011-12-17 02:31:16 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Eri organismi valgu ekspresseerimisel E. colis on üks oluline aspekt see, et algse organismi koodonikasutus erineb tõenäoliselt ekspressiooniks kasutatud E. coli koodonikasutusest ( Codon use bias).

Kuigi geneetiline kood on degenereerunud, pole kõik koodonid võrdsed. Nad võivad kodeerida sama aminohapet, kuid organismid eelistavad spetsiifilisi koodoneid teiste ees ja nende koodonite tRNA-d kipuvad esinema erinevates kontsentratsioonides. Kui teie järjestuses on nüüd palju koodoneid, mis on E. colis väga haruldased, kannatab see ekspressioon, kuna nende koodonite tRNA-d ei ole translatsiooni säilitamiseks piisavalt kõrge kontsentratsiooniga.

Seal on kaks võimalust selle kompenseerimiseks: kas saate oma E. coli toota rohkem haruldasi tRNA-sid või optimeerite oma järjestust erinevate koodonite kasutamiseks. Esimeseks lahuseks võite osta teatud E. coli tüved, mis sisaldavad plasmiide, mis kodeerivad E. colis harva esinevaid tRNA-sid, üks neist tüvedest on nt. Rosetta BL21 tüvi.

Koodoni kasutamise optimeerimiseks pakuvad mitmed ettevõtted optimeeritud järjestuste sünteesimist. Internetis on saadaval ka tööriistu, kuid mul pole nendega otsest kogemust.

Samuti pole optimeerimine nii lihtne kui lihtsalt iga kord kõige levinuma koodoni kasutamine, on näidatud, et koodonite optimeerimine vastavusse viimiseks tõlkekiirus algses organismis võib suurendada ekspressiooni saagist. Mõne valgu korral võib tõlke ajal olla vajalik pausikoht, et tagada õige voltimine. Kui valk ei klapi korralikult, laguneb see kiiresti ja teie saagis kannatab. Seda on kirjeldatud Angovi jt artiklis "Heteroloogse valgu ekspressiooni tõhustatakse, ühtlustades sihtgeeni kodooni kasutussagedusi ekspressiooni hostiga".

Kena ülevaate kogu teema kohta leiate Welshi jt artiklist "Sa oled üks googolis: geenide optimeerimine valgu ekspressiooniks".

Aitäh, hull teadlane! Jah, olen mõelnud koodoni optimeerimisele ja see on kindlasti minu tegevuste loendis. Vabandust, et unustasin seda mainida. DNA 2.0-l on tarkvara, mis teisendab teie järjestuse optimeerituks. Olen kuulnud ka Rosetta BL21-st, kuid pole seda kunagi kasutanud. Samuti võiksime soovida jääda oma tüve juurde, sest see on huvipakkuva või huvipakkuva ravimi tootja. Olen koodoni optimeerimise pärast veidi mures just valesti voltimise tõttu, kuid ma peaksin seda tegema.
Kuid see ei seleta ikkagi, miks teine ​​alaühik paremini ekspresseerib, samuti on sama natiivse organismi teised valgud E. colis hästi ekspresseeritud. Seepärast arvan, et pigem on küsimus transkriptsiooni ja tõlke kontrollelementide kui haruldase koodoni kasutamise osas.
@GerganaVandova Peaksite võrdlema oma kahe alaüksuse koodonikasutust, võib juhtuda, et üks kasutab rohkem haruldasi koodoneid kui teine.
Osalen Claes Gustafssoni jutust DNA2.0-st - ja ma arvan, et me teadsime seda juba -, et koodoni kasutamine on kasulik, kuid ei tööta alati. neil on patenteeritud meetod, mis on usaldusväärsem ...
#2
+6
Amy
2011-12-22 05:41:32 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Kas olete proovinud panna oma kaks geeni kahele eraldi plasmiidile (loomulikult erineva replikatsiooni alguse ja antibiootikumide valikuga) ning sel viisil ka ekspresseerida? Kui esimene kahest alaühikust ekspresseerib hästi ja teine ​​mitte, on see tõenäoliselt seetõttu, et ribosoomid langevad mRNA-lt maha enne teise geeni täielikku transkribeerimist. Kas geenid on eukarüootsed? Ma arvan, et E. coli ribosoome on keeruline "petta" heteroloogiliste järjestuste operonina käsitlemiseks, kuid võib-olla võiks aidata keegi, kellel on rohkem teadmisi prokarüootide tõlkimise kohta.

Tegelikult lisage lihtsalt teine ​​T7 promootor ette geenist 2 aitaks ilmselt üsna palju:

Geenid transkribeeritakse kas üksikutelt promootoritelt või ühelt promootorilt, mis viib pika polütsüstroonse mRNA tekkimiseni. On teatatud, et polütsistrooniline ekspressioon põhjustab allavoolu kodeeritava valgu madalamat ekspressiooni, mida saab kasutada valgukompleksi stöhhiomeetria mõjutamiseks (9). Teatatud on mitu korda suuremast ekspressioonist üksikute promootoritega võrreldes polütsüstroonse transkriptsiooniga (10). ( Allikas)

Ma tean omast kogemusest, et kahe plasmiidi kasutamine koosekspresseerimisel võib õigete geenidega väga hästi toimida!

Tänan sind vastuse eest. Mulle meeldib mõte lisada täiendav T7 promootor, kuigi korduvate järjestuste olemasolu võib põhjustada muid probleeme tulevikus (ma ei taha üksikasjadesse minna). Kuid ma töötan geenidega, mis on kolm korda suuremad ja üks promootor kahe subühiku jaoks töötab hästi. Võib-olla on see väga jadaspetsiifiline.
#3
+2
Nick T
2011-12-17 11:19:41 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Mad Scientist käsitles potentsiaalseid koodon-eelarvamusi käsitlevaid probleeme (mida saab Rosettasega leevendada), kuid üldisemalt olen näinud, et erinevate vektorite (pET-28 vs pET-24) ekspressioonikiirus on ilma nähtava põhjuseta tohutult varieerunud. Meie laboril on olnud tohutu edu IPTG-ga indutseeritavate vektoritega (pBC-SK-st pET-24-ni suurenenud ekspressioon 50 korda).

Peale ekspressiooni võib rakuvaba ekstrakti valmistamisel valk kaduma minna. See ei pruugi olla rakupelletis, kui see eksporditakse signaalpeptiidi nõusolekul, või võib see lüüsitud rakkude allapoole keerutades "prahi" pelletisse visata, kui see on halvasti lahustuv. Olen kuulnud teooriat, et lahustuvusprobleemidega võivad liialdada ekspordimasinaid küllastavad vektorid, mis võivad nii sünteesi takistada kui ka / või olla nii tõhusad, et põhjustavad lihtsalt sademeid. pET-süsteemi käsiraamat soovitab pikema (üleöö) ekspressiooniaja madalamal (15–20 ° C) aidata lahustuvusprobleemidel. Sõltumata põhjusest, suurendas signaalpeptiidi eemaldamine oluliselt paljude meie valkude ekspressiooni

#4
+2
Gergana Vandova
2012-01-07 01:15:01 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Leidsin väga toreda paberi: Geenide kujundamine edukaks valguekspressiooniks, mis hõlmab enamikku valgu ekspressiooni määravaid tegureid. Postitan selle osi, sest olen kindel, et see on mõnele teist kasulik.

Tõlget saab juhtida algatuse ja pikenemise tasemel. Tõlkimise algatamine sõltub peamiselt ribosoomi sidumissaidi (RBS) järjestusest ja varajast mRNA sekundaarsest struktuurist. Teised valgu ekspressiooni määravad tegurid on vähem mõistetavad, kuid sama tugevad.

1. Tõlkimise algatamine

Peamine komponent, mis mõjutab tõlkimise algatamist prokarüootides, on RBS , mis toimub avatud lugemisraami (ORF) AUG-st 5–15 baasi vahel alusta koodonit. Ribosoomi seondumine RBS-i Shine – Dalgarno (SD) järjestusega lokaliseerib ribosoomi initsiatsioonikoodonisse ... RBS-i afiinsus ribosoomi suhtes on kriitiline tegur, mis kontrollib tõhusust, millega uus algatatakse polüpeptiidahelad. See interaktsioon konkureerib võimalike aluse paaristavate interaktsioonidega, mis hõlmavad RBS-i piirkonda, mis võib moodustuda mRNA-s. Seega on nõrgema aluse paaritumisega ribosoomiga SD järjestused vastuvõtlikumad mRNA struktuuri häiretele. Kuid mõned katsed viitavad sellele, et liiga tugeva afiinsusega SD järjestused võivad olla kahjulikud, eriti madalamal temperatuuril, pidurdades esialgse pikenemise. Samuti on kriitiline optimaalne kaugus RBS-i ja alguskoodoni vahel 5–7 alusega konsensuse SD AGGAGG põhjal.

Paljud tõendusmaterjalid viitavad sellele, et ORF-i esialgsed 15–25 koodonit väärivad geenide optimeerimisel erilist tähelepanu. Uuringud on näidanud, et haruldaste koodonite mõju translatsioonikiirusele on nendes esimestes koodonites eriti tugev, ekspresseerimiseks nii Escherichia colis kui ka Saccharomyces cerevisiaes. E. colis näib, et peptidüül-tRNA väljalangemist algsete koodonite translatsiooni ajal rõhutab haruldaste NGG koodonite olemasolu. Need mõjud näivad olevat sõltumatud kohalikust mRNA sekundaarsest struktuurist. Samuti on tõsi, et ekspressiooni võib taastada 5'-järjestuse asendusega isegi järjestuste korral, millel pole eriti tugevat mRNA struktuuri või mis sisaldavad selles piirkonnas haruldasi koodoneid või muid ilmseid kahjulikke elemente.

2. Koodoni eelarvamus

Teine viis, kuidas peremeesorganismi koodoni sagedusi saab kasutada, on disainitud geeni peremeeskodoni sageduste sobitamine. Seda saab teha lihtsalt iga koodoni valimisega tõenäosusega, mis sobib peremeeskodoni sagedusega ... Kasutades geenikomplekte, mis olid geenikujunduse tunnuste poolest väga erinevad, Welch jt. leidis, et sünonüümsete koodonikasutussageduste varieerumisel oli sügav mõju E. colis toodetud valgu kogusele, sõltumata lokaalsetest 5 ’järjestuse mõjudest. Ekspresseerimisel ilmnes vähemalt kahe suurusjärgu varieerumine asenduse tõttu ORF algsest 15 koodonist. See variatsioon oli tugevas korrelatsioonis geenide globaalse koodoni kasutussagedusega, ehkki kõige suuremates ekspresseeritud variantides leitud koodoni sagedused ei vastanud genoomis või E. coli väga ekspresseeritud endogeensetes geenides leiduvatele. Mitmemõõtmeline analüüs näitas, et umbes kuue aminohappe spetsiifiliste koodonite sagedused võivad ennustada täheldatud erinevusi ekspressioonis. Pole selge, mis on selle seose biokeemiline alus.

3. mRNA struktuur ja translatsiooniline pikenemine

Kuigi paljud tõendid viitavad sellele, et mRNA struktuur võib häirida translatsiooni algatamist nii prokarüootides kui ka eukarüootides, on struktuuri mõju pikenemisele vähem mõistetav. Osaliselt võib see olla tingitud ribosoomide sisemisest helikaasi aktiivsusest, mis võimaldab translatsiooni isegi väga tugevate juuksenõelade kaudu ja võib välistada paljude struktuuride translatsioonikiiruse piiramise kas prokarüootides või eukarüootides. Veelgi olulisem on see, et mRNA struktuuri on raske ennustada, eriti aktiivselt tõlgitud sõnumite puhul, mis on pidevas voos erinevate volditud ja avamata olekute vahel.

4. Valguspetsiifilised tegurid, mis pakuvad täiendavat keerukust

Valk võib olla peremehes eriti ebastabiilne, eriti kui see on halvasti volditud omase ebastabiilsuse, piisavate proteesifaktorite puudumise või vale translatsioonijärgse vale tõttu modifitseerimine ... Sekreteeritavate ja membraanvalkude ekspressiooni võivad piirata nende valkude membraanile suunamise mehhanismid. On isegi võimalik, et valgu aminohappeline järjestus võib translatsiooni efektiivsust piirata. Näiteks arvatakse, et proliin tõlgitakse E. colis aeglaselt, olenemata sellest, millist koodonit kasutatakse.

Valgu ekspressioon võib rakule olla toksiline , mis põhjustab ekspressioonivektor või peremeesorganismi valgusünteesi pärssimine ... Toksilisuse vähendamise ühine strateegia on ekspressiooni langetamine talutava tasemeni. Erineva tugevusega promootorid võivad olla väärtuslikud vahendid maksimaalse saagikuse saavutamiseks optimaalse ekspressioonikiiruse leidmiseks ... Üks võimalikke viise mõne valgu toksilisuse vältimiseks on ekspressiooni suunamine periplasmasse või keskkonda. Selle võib saavutada sekretsioonisignaaljärjestuse N-terminaalse liitmise teel.

Lisateabe saamiseks lugege palun kogu paberit. Samuti soovitan lugeda disainiparameetreid Escherichia coli sünteetiliste geenide ekspressiooni kontrollimiseks.

Täname linkide eest! Olen varem koodoni optimeerimiseks ja geenide sünteesiks kasutanud DNA 2.0-d ja mul on olnud häid tulemusi - olen kindlasti huvitatud nende väljaannete lugemisest.
@Amy: Jah, osa paberist räägib DNA2.0 omadustest, mis on minu arvates väga kasulikud. Olen uus kasutaja ja harjun nende tarkvaraga endiselt, kuid see näeb siiani päris kena välja.


See küsimus ja vastus tõlgiti automaatselt inglise keelest.Algne sisu on saadaval stackexchange-is, mida täname cc by-sa 3.0-litsentsi eest, mille all seda levitatakse.
Loading...