Küsimus:
Miks nõuab T7 RNA polümeraas redutseerivat keskkonda st. DTT
bobthejoe
2012-03-28 03:52:14 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Iga verine protokoll soovitab in vitro RNA transkriptsiooni tegemisel lisada DTT-sse. Miks? Põhjendus näib olevat see, et tsütoplasmal on tavaliselt redutseeriv keskkond, kuid kuna ainus valk, mis meile korda läheb, on T7 polümeraas, miks see vajalik on.

Sul on õigus. Otsisin just paar protokolli (näide [Promega] lehelt (http://www.promega.com/~/media/Files/Resources/Protocols/Product%20Information%20Sheets/N/T7%20RNA%20Polymerase% 20 (Protokol.ashx)) ja selle lõppkontsentratsioon on 10 mM DTT. Nad ei selgita, miks, kuid selle lisamine peab olema oluline.
üks vastus:
Aleadam
2012-03-28 04:46:02 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Kiire T7 tsüsteiinide otsimine andis mõned vihjed:

Bakteriofaagi T7-indutseeritud DNA polümeraas koosneb 1: 1 faagi indutseeritud geeni 5 valgu ja Escherichia coli tioredoksiini kompleksist. Aktiivsete subühikute valmistamine sulfhüdrüülreaktiivide puudumisel näitab, et tioredoksiini redutseeritud vorm on aktiivse holoensüümi moodustamiseks piisav. Tioredoksiini oksüdeeritud vorm, ühes toimekohas sulfhüdrüüljodoatsetaadi või metüüljodiidi abil modifitseeritud tioredoksiin või N-etüülmaleimiidiga mõlemas aktiivses kohas modifitseeritud sulfhüdrüülrühmaga modifitseeritud tioredoksiin on kõik passiivsed, kuna kompleksi moodustamisel geeni 5 valguga on defektne.

Adler ja Modrich, J Biol Chem 258: 6956 (1983)

Seal on üks uuem artikkel ( Aguirre et al., Anorgaaniline keemia 48 : 4425 (2009)), kus mainitakse "ensüümi kriitilisi sulfhüdrüültsüsteiini rühmi ", kuid kahjuks on mul juurdepääs ainult abstraktsele.

Värskenda : näib, et see on pigem vana leid, mitte tsütoplasma redoksoleku seisundi põhjendus. Vastavalt Chamberlin and Ring, JBC 248: 2235 (1973),

Üldised nõuded - T7 DNA polümeraasi juhitud T7 RNA sünteesi üldnõuded on toodud tabelis I. Nagu matriitsiga suunatud polümeraasi puhul oodata, näitab RNA süntees absoluutset vajadust DNA, 4 ribonukleosiidtrifosfaadi ja Mg ++ järele.

(seal pole üllatusi;)

Ensüümi aktiivsus väheneb märkimisväärselt, kui sulfhüdrüül-redutseerija nagu b-merkapto-etanool välja jätta reaktsioon. 10 ^ -5 M p-hüdroksüercuribensoaadi lisamine proovisüsteemi b-merkaptoetanooli puudumisel kaotas kogu aktiivsuse, mis näitab, et ensüüm sisaldab aktiivsuseks vajalikku sulfhüdrüülrühma.

Siiski , kui näete tabelit I, on pärast bme eemaldamist järelejäänud tegevus endiselt 74%

Tundub, et kokku puutub 7 tsüsteiini ( Mukherjee et al., Cell 110: 81 (2002)), kuid ma ei leidnud ühtegi paberit, mis nende rolle arutaks.

Siin on koopia paberist. Naudi.http: //cl.ly/101U380b3r261i0w0v1d
Kui imelik. Vaatan kristallstruktuuri (1QLN) ja aktiivse saidi läheduses pole palju tsüsteiini. Peab neid pabereid vaatama.
@jp89 Täname paberi koopia eest. Ma pole siiski kindel, kas see on siin lubatud, kuna see rikub autoriõigusi. Igatahes usun, et see on endiselt õiglane kasutamine. Küsimuse osas järgiksin sealt viiteid 59–62 (viimane lõik lk 2 / esimene lk 3). Terviseks.
Bakteriofaagi polümeraas on rakus aktiivne, millel on redutseeriv keskkond. Enamik rakusisestest valkudest sisaldab sel põhjusel DTT või glutatiooni. Disulfiidid on enamasti sekreteeritud valkude jaoks.
@Aleadam Jah, see on kurb juhtum. Ma ausalt ei mõista inimõiguste autoriõiguste kaitse mõistet.
@jp89 paraneb aeglaselt PLoS-i jõupingutuste ja NIH-i käsikirja nõuetega, kuid veel on pikk tee minna


ⓘ
See küsimus ja vastus tõlgiti automaatselt inglise keelest.Algne sisu on saadaval stackexchange-is, mida täname cc by-sa 3.0-litsentsi eest, mille all seda levitatakse.
Loading...